Clínica FGO - Fertilização In Vitro (FIV)
  

A mais conhecida é a fertilização in vitro (FIV), popularmente chamada de "bebê de proveta". Esse procedimento envolve várias etapas. Na primeira etapa, denominada estimulação ovariana controlada, a paciente recebe drogas indutoras da ovulação para aumentar a produção de óvulos. Em seguida, com o auxílio de uma ultra-sonografia transvaginal, os óvulos são coletados e levados ao laboratório. Paralelamente, os espermatozóides do paciente são preparados em laboratório de modo que, para cada óvulo a ser fecundado, haja cerca de 50 a 100 mil espermatozóides móveis. Na etapa seguinte, totalmente desenvolvida em laboratório, os óvulos e espermatozóides são colocados em um meio especial de cultura para que ocorra a fecundação. Se a fertilização for bem sucedida, dará origem a pré-embriões, que serão transferidos para o útero da paciente em 48, 72 ou até 120 horas após a coleta dos óvulos. Uma vez dentro do útero o pré-embrião transforma-se numa estrutura esférica chamada blastocisto num espaço de tempo que leva de 3 a 5 dias. É nesse momento que acontece a implantação e o início da gravidez. Entretanto, somente depois de passados 12 dias da transferência dos pré-embriões para o útero é que solicitamos o teste de sangue para determinação da presença de gravidez – é a dosagem de beta-HCG no sangue. Um exame positivo com beta-HCG acima de 30 UI/mL é sinal de gravidez evolutiva.

1 - ESTIMULAÇÃO DA OVULAÇÃO

Esta é a primeira fase do tratamento onde é realizada a estimulação dos ovários com medicações hormonais (FSH recombinante) cujo objetivo é produzir número suficiente de óvulos, de modo geral acima de 6 óvulos maduros, para que se possa fazer uma seleção de embriões de excelente qualidade do ponto de vista morfológico e de velocidade de crescimento, para serem transferidos para o útero da paciente. Uma vez que sejamos capazes de transferir embriões de excelente qualidade para o útero materno, estaremos garantindo uma ótima chance de gravidez.

Como podemos observar essa etapa influencia de modo significativo o sucesso das outras etapas do processo. Por isso, ela deve ser muito bem controlada e a medicação deve ser muito bem dosada, pois cada paciente poderá responder de modo diferente à mesma dose de remédio (FSH) administrada. Devemos evitar nessa etapa tanto a falta quanto o excesso de resposta ao estímulo.  Por isso é de fundamental importância conhecer dados clínicos da mulher como peso, altura e as características dos ovários ao ultra-som transvaginal, medidas no terceiro dia do ciclo menstrual. Nesse momento já é possível prever que dose será suficiente para a maioria das pacientes.

Existem diversas maneiras de estimular os ovários (protocolos de estimulação). A grande maioria das clínicas segue uma mesma linha de estimulação ovariana.

A estimulação ovariana pode ser dividida em 2 fases: fase inicial ou de bloqueio e a fase de estimulação. Fase de bloqueio: a paciente usará uma medicação que tem como objetivo bloquear a ação da hipófise sobre o ciclo menstrual natural, por isso o tratamento poderá começar em qualquer fase do ciclo menstrual. O bloqueio é necessário para termos um controle total do ciclo de tratamento, além de fazer com que todos os folículos (estruturas do ovário onde os estão óvulos) cresçam juntos, evitando a ovulação antes da hora.

Uma outra forma mais recente de estimulação, que tem a vantagem de economizar dias de estímulo e injeções, é aquela em que começamos a medicação FSH recombinante no 3º dia do ciclo menstrual. A medicação para bloquear a hipófise só começa a ser utilizada quando os folículos estão com diâmetro em torno de 14 mm. Esse esquema encurta em 15 dias o ciclo de tratamento.

Resumindo: Durante a estimulação a paciente usará uma medicação (hormônio folículo-estimulante – FSH recombinante) que vai agir sobre os ovários, provocando a formação de óvulos maduros que serão aspirados. Em um dado momento da estimulação, a paciente deverá fazer controles diários ou em dias alternados de Ultra-sonografia e dosagens hormonais (estradiol e progesterona), pois com isso saberemos exatamente o melhor momento para marcar a aspiração dos óvulos. A avaliação do desenvolvimento folicular é feita pela medição do diâmetro médio do folículo com ultra-som transvaginal. Quando pelo menos dois folículos atingem um diâmetro maior ou igual a 18-20 mm administra-se uma nova medicação com hora marcada chamada hCG (gonadotrofina coriônica humana) e 34-36 horas após realizamos a coleta dos óvulos.

2- CAPTAÇÃO DOS ÓVULOS

No momento em que temos pelo menos 2 folículos, cujo diâmetro médio é maior ou igual a 18 mm, fazemos a administração de hCG (gonadotrofina coriônica humana), 10.000 UI por via  intramuscular, e cerca de 34 a 36 horas após fazemos a captação dos óvulos, através da aspiração transvaginal dos folículos ovarianos, guiada pelo Ultra-som. É um procedimento simples que exige uma leve sedação, ou seja, a paciente dorme durante alguns minutos, enquanto seus óvulos são coletados dos ovários. Uma agulha comprida e fina é dirigida ao fundo da vagina pelo próprio dispositivo de fazer ultra-som transvaginal (o chamado transdutor). Nessa região, ou seja, no fundo da vagina é que encontramos os ovários repletos de folículos contendo os óvulos. Com o transdutor posicionado sobre cada ovário (primeiro do lado direto e depois do lado esquerdo) fazemos uma punção com a agulha guiada pelo ultra-som, o que nos permite aspirar cada um dos folículos ovarianos que contém óvulos. Esse líquido aspirado de cada folículo (e que contém o óvulo) cai direto dentro de um tubo de plástico apropriado, acoplado à agulha, que é encaminhado ao laboratório de embriologia para identificação e classificação do óvulo. Após o procedimento a paciente descansa por 20 minutos e retorna a sua residência ou ao trabalho, onde vai aguardar as orientações para as próximas etapas. 

3 - FERTILIZAÇÃO EM LABORATÓRIO E FORMAÇÃO DOS PRÉ-EMBRIÕES PELA TÉCNICA DE FIV CONVENCIONAL E PELA TÉCNICA DE ICSI (MICROMANIPULAÇÃO DOS GAMETAS E OBSERVAÇÃO DO DESENVOLVIMENTO DOS PRÉ-EMBRIÕES)

Uma primeira forma de fertilização é a fertilização in vitro convencional (FIV convencional). Consiste em colocar um óvulo para cada 100 a 150 mil espermatozóides dentro de um recipiente apropriado feito de plástico inerte contendo um meio de cultura específico, para que apenas um desses espermatozóides penetre em cada óvulo disponível. Deste modo, os gametas masculinos vão procurar fertilizar o óvulo por sua própria “vontade”.

Uma outra maneira de fertilização é a injeção intra-citoplasmática do espermatozóide (ICSI), ou seja, um único espermatozóide será apanhado por uma microagulha e será injetado dentro de cada óvulo disponível. A injeção de um único espermatozóide em cada óvulo maduro (em estado de metafase II ou MII) é feita após a limpeza dos mesmos em meios e soluções especiais.

A fertilização (presença de 2 pronúcleos) é verificada em microscópio invertido cerca de 18 hs após, tanto na FIV convencional quanto na ICSI.

Os pré-embriões, nessa fase denominados de zigotos, são colocados em cultura onde serão avaliados quanto ao seu desenvolvimento e clivagem. É desta forma que determinamos a qualidade embrionária. De maneira geral, os pré-embriões de boa qualidade são aqueles com uma taxa de crescimento e clivagem (divisão) normais (duplicam o número de células a cada 24 h, ou seja, em 24 h = 2 células, em 48 h = 4 células, em 72 h = 8 células e assim por diante). As células são simétricas e há muito pouco acúmulo de fragmentos celulares no interior de um pré-embrião de excelente qualidade. Alguns fatores como os meios de cultura, a temperatura e o pH do meio podem influenciar no bom desenvolvimento e na qualidade dos pré-embriões. Por isso eles devem ser mantidos em estufas especiais e sob condições também especiais de temperatura e pH. Devem ser transferidos para o útero materno tão logo seja possível. 

4 - TRANSFERÊNCIA DOS EMBRIÕES  

A colocação dos embriões no interior da cavidade uterina é feita cerca de 48-72 h, às vezes até 120h, após a captação dos oócitos e fertilização dos mesmos. É um procedimento rápido e simples e não requer sedação ou anestesia. Os pré-embriões são colocados em um diminuto tubo de plástico inerte (catéter de transferência), cujo diâmetro é pequeno o suficiente para ultrapassar o canal cervical e chegar ao interior da cavidade uterina. Nesse ponto os pré-embriões são “empurrados” para o revestimento interno do útero (endométrio) através de uma mínima pressão sobre o êmbolo da seringa de insulina que está acoplada ao catéter de transferência. Esse processo todo é realizado com bexiga cheia e sob controle ultra-sonográfico para monitorizar a posição do catéter e o local correto para colocar os pré-embriões dentro da cavidade uterina. A paciente já com os pré-embriões dentro do útero permanece 15 a 20 minutos de repouso após o procedimento e é liberada para casa onde deverá permanecer sem atividade física intensa por mais 24 horas. O ideal é não programar viagens para o mesmo dia da transferência. Dois dias após o procedimento a paciente pode ter vida normal, inclusive pode ter relações sexuais com o marido sem se preocupar. 

5 – SUPORTE DA FASE LÚTEA 

Uma vez que os pré-embriões estão dentro da cavidade uterina, o uso de hormônios que auxiliam o fenômeno da implantação (ligação do embrião ao revestimento uterino) é obrigatório. O mais importante deles é a Progesterona. É importante ressaltar que esse hormônio além de auxiliar a implantação por estimular a secreção de substâncias nutrientes ao nível do endométrio que irão nutrir o pré-embrião, é um excelente relaxante uterino, que pode evitar contrações uterinas excessivas nessa fase. A Progesterona na forma de supositórios vaginais (Crinone – 8 mg) duas vezes ao dia, via oral (Utrogestan, Evocanil) 200 mg, quatro vezes ao dia, são os esquemas de administração mais frequentemente utilizados. 

 6 - TESTE DE GRAVIDEZ 

A dosagem de beta – hCG é feita no sangue 12 dias após a transferência dos pré-embriões, e um valor acima de 30 UI/ml é considerado positivo para gravidez de boa evolução. 

7 – VERIFICAÇÃO DA GRAVIDEZ CLÍNICA 

Quinze a vinte dias após a dosagem do beta-HCG positiva é feito um primeiro exame de ultra-som transvaginal para verificar a presença do saco gestacional e do polo embrionário em desenvolvimento. Nesse momento nós avaliamos a gravidez e o bebê em desenvolvimento. Nos asseguramos a paciente também de que a gravidez está dentro do útero e também determinamos se há implantação de mais de um embrião (gêmeos).
 

A técnica de ICSI consiste na imobilização e injeção de um único espermatozóide dentro do óvulo sob visão microscópica. Em 1992, o grupo do Dr. Van Steirteghem, na Bélgica, relatou as primeiras gestações humanas e nascimentos após a transferência de pré-embriões gerados por este procedimento de fertilização assistida.

O uso da ICSI difundiu-se por todo o mundo. A técnica é segura, eficaz e leva à produção pré-embriões com excelentes taxas de implantação. A conseqüência desse fato, é que a ICSI tem sido usada em todo o mundo com sucesso para tratar a infertilidade masculina resultante de baixíssima contagem de espermatozóides (oligoastenospermia grave), alterações da forma e da vitalidade do espermatozóide (teratozoospermia) e até em casos de ausência de espermatozóides no sêmen ejaculado (azoospermia).

Há cerca de 28 anos Steptoe e Edwards foram responsáveis pelo nascimento do primeiro bebê produzido através da fertilização in vitro em laboratório (FIV convencional). Esse foi um dos maiores avanços no tratamento da infertilidade. A FIV tornou-se a melhor opção de tratamento para alguns tipos de infertilidade, incluindo infertilidade de causa feminina e infertilidade de causa masculina.

Muitos casais com infertilidade devido a fator masculino, entretanto, não foram ajudados pela FIV convencional. Os maridos, nesses casos, tinham número extremamente baixo de espermatozóides com alterações de motilidade e morfologia. Essas alterações levavam quase sempre à falha de fertilização e falta de sucesso do ciclo de FIV. Homens com concentrações de espermatozóides abaixo de 500 mil por mililitro eram frequentemente recusados para tratamento pela FIV convencional.

A maneira mais eficiente de tratar a infertilidade masculina é a utilização da técnica da ICSI: é necessário apenas um único espermatozóide vivo para cada óvulo maduro.

As indicações para ICSI não são restritas as alterações morfológicas dos espermatozóides, mas incluem também baixa motilidade e concentração de gametas masculinos. A prática de ICSI indica que resultados semelhantes são obtidos através da ICSI com sêmen anormal e FIV convencional com sêmen normal. A ICSI com espermatozóides do ejaculado, pode ser utilizada com sucesso em pacientes com falha de fertilização após a FIV convencional.

Outra indicação da ICSI é o caso de homens com ausência de espermatozóides na ejaculação (Azoospermia). É importante ressaltar que 96 de cada 100 homens possuem espermatozóides no sêmen ejaculado. Por outro lado, 4 em cada 100 homens não possuem espermatozóides no sêmen ejaculado. Desses 4 homens, três terão espermatozóides nos epidídimos ou testículos e apenas um terá que utilizar o banco de sêmen doador. Essa forma de infertilidade masculina está associada à obstrução de ductos excretores genitais masculinos (azoospermia obstrutiva) ou à deficiência na produção de espermatozóides (azoospermia não obstrutiva) e pode ser tratada pela ICSI pela retirada cirúrgica dos espermatozóides do epidídimo ou dos testículos.

Os espermatozóides do epidídimo são obtidos principalmente com a aspiração percutânea com agulha fina (PESA – do inglês percutaneous epydidimal sperm aspiration) precedida de anestesia local. Os espermatozóides dos testículos podem ser obtidos de duas formas: uma biópsia (TESE - do inglês testicular sperm extraction) ou uma aspiração com agulha fina (TESA – do inglês testicular sperm aspiration), ambas precedidas de anestesia local.

A biópsia testicular também tem sido usada em alguns casos de azoospermia não obstrutiva. Os espermatozóides podem ser encontrados, algumas vezes, após a realização de múltiplas biópsias em pacientes com disfunção testicular severa e com ausência de formação de células germinativas (síndrome de células de Sertoli ou Sertoli Only Cell Syndrom) ou com formação e maturação inadequadas de espermatozóides. A retirada de espermatozóides pode não ser sempre bem sucedida em todos os pacientes de azoospermia. Entretanto, não existe um indicador preciso para o sucesso da retirada dos espermatozóides testiculares. Ótimos espermatozóides retirados através da biópsia testicular podem ser obtidos por uma lavagem delicada do tecido. Com muita frequência, espermatozóides vivos podem ser encontrados após o tratamento enzimático das amostras testiculares, para eliminação de células vermelhas.

Os espermatozóides obtidos por essas técnicas podem ser congelados e utilizados com eficácia em ciclos de ICSI subsequentes. Há vários casos relatados de gravidez após uso de espermatozóides congelados dos testículos e epidídimos. A vantagem desse congelamento está no fato de o marido não precisar repetir a retirada cirúrgica dos gametas.

O procedimento do ICSI não pode ser realizado nos casos de ausência de óvulos na captação ou ausência de espermatozóides após a realização da biópsia testicular. Isso acontece em aproximadamente 3% dos ciclos. Nesses casos a utilização de sêmen ou óvulos de doador deve ser considerada.

A prática da ICSI nos últimos 14 anos tem revelado segurança, eficácia e prole nascida semelhantes à FIV convencional, o que tem generalizado sua indicação para praticamente todos os casos de infertilidade, mesmo sem a presença do fator masculino de infertilidade.
 

Como é realizada a PESA

A técnica da PESA é simples. O procedimento é feito com leve sedação, pois é doloroso. Uma agulha fina conectada a uma seringa de 1 ml é inserida diretamente no epidídimo, perpendicular à pele do escroto. Puxando o êmbolo da seringa cria-se uma pressão negativa de sucção.  Uma diminuta quantidade de líquido é sugada pela seringa, o que é observado pela entrada imediata de pequena quantidade de fluido no interior da seringa. Neste momento, a agulha é retirada e o material encaminhado ao laboratório. A seguir, uma pequena gota do material é examinada ao microscópio e a presença ou não de espermatozóides móveis é comunicada ao médico. Quantidades mínimas do líquido aspirado podem conter milhões de espermatozóides. Ao final do procedimento, o paciente é liberado, podendo voltar ao trabalho imediatamente.

O material excedente da aspiração pode ser congelado para utilização em ciclos futuros de ICSI, evitando-se outra punção. Se não encontramos espermatozóides, nova aspiração deverá ser realizada, no mesmo local, ou no lado oposto, antes de utilizarmos outra técnica para a obtenção de espermatozóides. Nos casos de falha da PESA, o mais efetivo será realizar a aspiração percutânea de espermatozóides do testículo (TESA) ou uma pequena biópsia testicular (TESE), cujo objetivo é encontrar espermatozóides alternativamente nos testículos.

2 - TESA - ASPIRAÇÃO PERCUTÂNEA DE ESPERMATOZÓIDES DO TESTÍCULO (Testicular Sperm Aspiration) e TESE - PEQUENA BIÓPSIA TESTICULAR (Testicular Sperm Estraction)

Não há como prever a presença ou ausência de espermatozóides no tecido testicular de pacientes acometidos pela azoospermia não-obstrutiva, antes da realização das técnicas deTESE/TESA. Mesmo nos casos de síndrome da presença apenas de células de Sertoli (Sertoli Cell Only Syndrom), algumas regiões do testículo (cerca de 30-40% dos casos) poderão apresentar produção reduzida de espermatozóides. Por outro lado, um indivíduo com testículos de tamanho normal, azoospérmico, pode apresentar parada de maturação germinativa completa, e pode não ser possível obter qualquer espermatozóide através da TESE/TESA.

Assim sendo, é extremamente importante oferecer ao casal a opção de utilizar sêmen de doador, quando não for possível encontrar espermatozóides na TESE/TESA.

Existem dois métodos para se obter espermatozóides do testículo: a extração de espermatozóides pela biópsia aberta (TESE - Testicular Sperm Extraction) e a aspiração percutânea de espermatozóides do testículo com auxílio de agulha fina (TESA - Testicular Sperm Aspiration). Ambos podem ser realizados sob anestesia local (bloqueio do cordão espermático) ou sedação leve.

No caso da biópsia aberta (TESE), realiza-se incisão de 1,0 cm na pele do escroto. O testículo é pressionado gentilmente, para que haja extrusão dos túbulos seminíferos, e este fragmento é excisado com auxílio de tesoura microcirúrgica. O fragmento de testículo é então, enviado ao laboratório para identificação e separação dos espermatozóides. Na maioria dos casos, apenas um fragmento é suficiente para fornecer espermatozóides para a ICSI. Múltiplas biópsias podem ser necessárias, entretanto, nos casos de azoospermia não-obstrutiva secundária à parada de maturação germinativa ou à síndrome da presença apenas de células de Sertoli. O paciente recebe alta após 1 hora, em média, e poderá retornar ao trabalho no dia seguinte.

A aspiração testicular com agulha fina (TESA) é um procedimento simples. Uma agulha 21 ou 23 G tipo "butterfly" conectada à seringa de 20 ml é introduzida diretamente no testículo, perpendicular à pele do escroto, criando-se imediatamente pressão negativa de sucção ao puxarmos o êmbolo da seringa. Deve-se realizar de 6 a 8 incursões da agulha, em diferentes direções, no interior do testículo. Ao final do procedimento, a agulha é retirada e o material encaminhado ao laboratório para identificação e separação dos espermatozóides.

Devido à simplicidade do procedimento, consideramos a TESA como a primeira opção para a obtenção de espermatozóides do testículo, passando-se à TESE nos casos de falha da primeira.
 

1. Preparo dos Oócitos para ICSI

Os óvulos, juntamente com o líquido folicular, são coletados em um tubo de plástico inerte especial previamente aquecido e imediatamente enviados ao laboratório de embriologia, onde, através de um microscópio especial, serão identificados e posteriormente classificados.

2. Preparo dos Espermatozóides para ICSI

O sêmen é coletado através de masturbação no dia da aspiração dos óvulos. É imediatamente enviado ao laboratório de embriologia para a liquefação da amostra e preparo para ICSI. Há uma separação dos espermatozóides de morfologia e motilidade normais. Esses serão utilizados durante a injeção de ntro do óvulo. Se há azoospermia (ausência de espermatozóides no ejaculado) uma das técnicas de obtenção de espermatozóides (PESA,TESA ou TESE) será utilizada.

3. Imobilização e Microinjeção dos Espermatozóides

Um único espermatozóide é selecionado e imobilizado mecanicamente com uma leve pressão da pipeta de injeção sobre a sua cauda. O espermatozóide é então aspirado pela cauda para dentro da pipeta de injeção. O oócito é fixado com uma pequena sucção da pipeta que o prende. Apenas 1 espermatozóide imobilizado dentro da pipeta de injeção é injetado dentro do óvulo na posição de 3 horas de um relógio imaginário. Após a introdução da pipeta dentro do citoplasma do óvulo o espermatozóide é finalmente depositado e liberado no interior do gameta feminio. A pipeta de injeção é lentamente retirada do interior do óvulo, sob observação atenta do biólogo. Após a injeção , os óvulos são lavados em meio especial e colocados todos juntos em recipiente próprio coberto com óleo mineral . Eles serão armazenados na incubadora até a verificação da fertilização, ou seja até sabermos se houve a fecundação de fato.

4. Verificação da Fertilização (Fecundação)

A verificação da fertilização é feita através do microscópio invertido em aumento de 400X ,16 a 18 horas após a ICSI. A presença dos prónucleos e corpúsculos polares, além de anormalidades na fertilização (ausência de prónucleos, mais de dois prónucleos, degenerações, etc.) é verificada.  A fertilização é considerada normal quando dois prónucleos forem visualizados, contendo nucléolos em seu interior. Se apenas um prónucleo for visualizado, uma segunda avaliação é feita após 4 horas. Quando for detectada a presença de três ou mais prónucleos (PN), esse embrião é imediatamente descartado.

Os oócitos fertilizados são lavados em meio de cultura especial e agrupados 2 a 2 em recipientes em forma de placa. Essas placas são colocadas novamente na incubadora onde permanecem, de modo geral, até 72 horas após a ICSI (Dia 3). Caso a transferência seja realizada no dia 3 (72 horas), os embriões deverão permanecer em meio de cultura específico até 48 horas após o que o mesmo deve ser renovado.

5. Transferência dos Pré-embriões

Os pré-embriões são avaliados e classificados quanto ao número e simetria de suas células de acordo com o tempo de desenvolvimento. Além disso, a presença de fragmentos de células é também avaliada. Com essa análise o embriologista é capaz de nos dar uma idéia da qualidade do pré-embrião em relação a chance de implantação. No dia 3 esperamos um embrião com 6 a 8 células simétricas e com pequena quantidade de fragmentos de células no seu interior. Esse seria um pré-embrião de excelente qualidade, isto é, com um alto poder de implantação no revestimento uterino interno. A avaliação é feita momentos antes da transferência para o útero. Uma vez que o embriologista decidiu quais pré-embriões serão transferidos, eles são aspirados do meio de cultura em que estavam para dentro de um dispositivo tubular muito fino e delicado (chamado catéter de transferência) sob visão microscópica. Esse catéter já carregado com os pré-embriões, acoplado a uma seringa de insulina, é levado até o médico que vai introduzí-lo dentro da cavidade uterina da paciente e então empurrar os pré-embriões para o interior do revestimento uterino interno (endométrio), pressionado delicadamente o êmbolo da seringa.

A fertilização in vitro (FIV) é a base de todas as técnicas de reprodução assistida. Apesar de ser altamente eficaz, muitos casais necessitam de procedimentos adicionais para aumentar as chances de sucesso do tratamento. Conheça as principais:

1 - ASSISTED HATCHING (AHA)

É o afinamento e/ou amolecimento da zona pelúcida (um tipo de casca que protege o embrião) através de substâncias químicas ou laser. É um processo que tem por objetivo facilitar a implantação do pré-embrião no revestimento uterino. “É como se facilitássemos a saída de um pintinho do ovo pelo afinamento da casca”. Na realidade a palavra hatching em inglês quer dizer o ato de chocar. O AHA pode ser realizado nos pré-embriões em qualquer estágio de divisão, de duas células até blastocisto. A maioria dos grupos realiza o procedimento no dia da transferência intra-uterina a 65-72 horas após a inseminação. Os pré-embriões com a zona pelúcida espessa (>15 mm), pré-embriões de mulheres com níveis de FSH elevado e pré-embriões de mulheres com mais que 38 anos são os mais beneficiados com a técnica de AHA.

2 - PGD (DIAGNÓSTICO GENÉTICO PRÉ - IMPLANTACIONAL)

O diagnóstico genético de gametas e embriões antes da implantação no útero só foi possível após os recentes avanços de micromanipulação no campo da fertilização" in vitro" (FIV). Do ponto de vista histórico, o PGD pode ser visto como uma extensão do diagnóstico genético pré-natal. A aplicação do PGD gerou considerável controvérsia da mesma forma que a FIV quando foii introduzida no mundo. Apesar disso, após o relato da primeira gestação com uso do PGD, o número de casos de diagnóstico genético pré-implantação tem aumentado constantemente. Desde 1997 centenas de bebês saudáveis vieram ao mundo graças a essa nova tecnologia.

O PGD é um procedimento que exige um bom entendimento de embriologia e biologia molecular. Durante a FIV, os oócitos e os pré-embriões em estágios precoces de clivagem são facilmente acessíveis permitindo, portanto, uma ou mais biópsias dessas células. No entanto, a quantidade de material genético, suficientemente segura para a realização dos testes, permanece ainda limitada para a confirmação de diagnósticos. Os protocolos atuais de transferência de pré-embriões exigem uma sincronização do estágio embrionário com a receptividade uterina. Há apenas uma pequena "janela de oportunidade" para se completar a tarefa de diagnóstico genético pré-implantação (o tempo da "janela de implantação"). Apesar dessas barreiras, o PGD vem se tornando, rapidamente, parte integrante de muitos programas de FIV.

Até o agora, as três maiores aplicações do PGD são:

1. O sexo de um pré-embrião pode ser confiavelmente determinado através da FISH ( fluorescent "in situ" hibridization ) usando "probes" específicos para os cromossomas X ou Y, ou por análises de sequências cromossômicas usando a técnica de PCR ( Polymerase Chain Reaction ). Dessa forma, doenças ligadas ao sexo podem ser determinadas e evitadas.

2. A enumeração da composição cromossômica pode ser conseguida através da FISH, permitindo, assim, a determinação da ploidia exata do pré-embrião concomitante com o diagnóstico de certas aneuploidias mais comuns. Em mulheres com idade materna avançada, isso reduz ou mesmo elimina o risco de dar à luz a uma criança com Trissomias, tais como a Trissomia do 21 ( Síndrome de Down ). A FISH pode ser usada também para detectar anomalias cromossômicas estruturais em casos de translocações balanceadas.

3. Defeitos Genéticos envolvendo um único gene ( tais como Fibrose Cística, Anemia Falciforme, Doença de Tay-Sachs ) e outras doenças comuns com alterações genéticas podem ser detectadas pela PCR.
 

A biópsia de um embrião consiste na remoção de um ou dois blastômeros para o diagnóstico de pré-implantação. Para o sucesso da técnica é preciso que o blastômero removido esteja intacto e apropriado para o procedimento de diagnóstico e que o embrião biopsiado mantenha o potencial para desenvolver e implantar dentro do endométrio.

O número de blastômeros a serem removidos dependerá do estágio de desenvolvimento do embrião. Quanto mais células estiverem presentes no embrião, mais células poderão ser retiradas na biópsia. Os embriões mais indicados para o diagnóstico de pré-implantação são os embriões em divisão celular com 8 células. Inúmeros estudos demonstram que um embrião com 8 células biopsiado tem o mesmo potencial de um embrião não biopsiado de chegar ao estágio de blastocisto, depois de dois ou três dias em cultura "in vitro".

Usando a técnica de micromanipulação, o embrião é imobilizado com a pipeta de "holding" (imobilização). Um furo de aproximadamente 35mm é feito na zona pelúcida pela borrifação de solução ácida de Tyrode's através de uma pipeta de diâmetro aproximado de 10mm . Uma vez que o furo tenha sido feito na zona pelúcida , a pipeta com o ácido de Tyrode's é removida e os blastômeros são aspirados através do "furo" criado na zona pelúcida através de uma micropipeta de 35mm de diâmetro. Depois do procedimento de biópsia, os embriões são transferidos para o meio de cultura contendo G2.2 ou HTF + 15% SSS e cultivados in vitro em uma atmosfera a 37°C com 5% de CO2.

A verificação dos embriões quanto à sobrevivência após a biópsia é checada 1 hora após o procedimento, em microscópio invertido com aumento de 400X. O embrião é considerado intacto se os outros blastômeros permanecerem intactos.

A análise eficiente dos genes do DNA ou dos cromossomos pode ser obtida com apenas uma célula. Os métodos mais comuns de diagnóstico pré-implantação são a PCR (Polymerase Chain Reaction) e a FISH (Fluorescent "In Situ" Hibridization).

A PCR é uma técnica muito utilizada para análise de DNA a nível de um único gene. Utiliza apenas o DNA de uma única célula, pois o mesmo é amplificado "in vitro", o que permite o diagnóstico teórico de qualquer doença genética cujo gene causador seja conhecido.

A FISH é uma técnica que permite a análise do DNA ao nível cromossômico. Tem a vantagem de fornecer resultados em apenas 2 a 4 horas. As doenças cromossômicas mais pesquisadas atualmente são aquelas que envolvem as trissomias de 13, 18 e 21. Através da FISH pode-se determinar com segurança o sexo embrionário, e portanto, inferir sobre doenças genéticas ligadas aos cromossomos sexuais.
 

Fragmentos de citoplasma podem ser removidos através de sucção delicada, após a abertura de um furo na zona pelúcida (uma membrana que protege o embrião). Esse procedimento beneficia o desenvolvimento os pré-embriões com excesso de fragmentação. Certos tipos de fragmentos são facilmente removíveis, particularmente, aqueles que estão livres dentro do espaço peri-vitelino. Por outro lado, os fragmentos que estão ligados aos blastômeros (que não se soltaram completamente de suas superfícies) devem ser deixados intactos. A remoção de fragmentos é uma técnica que demanda tempo e paciência, contudo, não é preciso remover todos eles; um resultado final de 5 a 10% de fragmentação restante deve ser suficiente.

SEQUÊNCIA DE REMOÇÃO DE FRAGMENTOS

Em raras ocasiões ( < 1% dos pré-embriões manipulados ) os blastômeros podem ser danificados durante a remoção de fragmentos. Quando esse fato ocorre, o blastômero danificado deve ser removido. Taxas razoáveis de gravidez após biópsia de blastômeros sugerem que o desenvolvimento subseqüente do embrião não deve ser afetado pela retirada de um único blastômero. Durante o processo de congelamento/descongelamento, um ou mais blastômeros podem se degenerar e morrer. O material degenerativo resultante deve ser removido após o AHA. Isso permitirá a transferência apenas de embriões limpos do material que poderia impedir seu desenvolvimento. Os blastômeros mortos ou degenerados devem ser removidos logo após o descongelamento.

CRIOPRESERVAÇÃO DE GAMETAS E EMBRIÕES

A primeira gravidez com embrião congelado foi relatada no mundo há cerca de 20 anos. Desde então, a maioria dos programas de fertilização "in vitro" (FIV) utiliza a ciência da criobiologia com a intenção de aumentar a oportunidade de gravidez em um único ciclo de estimulação ovariana. Como os protocolos de indução da ovulação aumentaram o número de oócitos saudáveis captadoshouve a necessidade de armazenar os oócitos e embriões supranumerários. Não é raro hoje em dia, coletarmos 10 ou mais oócitos maduros de uma mulher. Antes das técnicas de congelamento serem rotineiramente usadas no laboratório, a mulher que produzia muitos gametas tinha um número limitado de oócitos a serem inseminados ou risco de ter pré-embriões saudáveis descartados, porque somente três ou quatro pré-embriões poderiam ser transferidos com segurança para o útero após a fertilização. Hoje, tem sido demonstrado que os resultados de gravidez após o descongelamento, em alguns centros que realizam o congelamento, são semelhantes aos resultados de transferência de pré-embriões frescos.

TÉCNICAS DE CONGELAMENTO

O principal objetivo de um programa de congelamento é causar o menor dano possível no momento em que os gametas e embriões estiverem expostos a uma temperatura muito baixa não-fisiológica. Os protocolos usados hoje em dia envolvem técnicas de congelar-seco, que permitem a desidratação da célula para prevenir a formação de gelo intracelular.  As técnicas mais utilizadas são a vitrificação e o congelamento ultra-rápido cuja proposta é proteger a célula evitando a total formação de cristais de gelo no seu interior.

CRIOPRESERVAÇÃO DE  ÓVULOS

Os óvulos são facilmente congelados se possuem um núcleo. Estudos usando oócitos humanos em estágio de vesícula germinativa coletados de ciclos estimulados e não estimulados demonstraram que este estágio tem taxas aceitáveis de sobrevivência e maturação depois do descongelamento. A habilidade de congelar oócitos humanos não fertilizados pode ser inestimável em alguns casos. Uma jovem mulher em tratamento de radioterapia ou que tenha que passar por uma perda dos ovários pode ser muito beneficiada. Similarmente, uma mulher velha querendo estocar múltiplos oócitos antes de perder a função ovariana pode ser ajudada por esta tecnologia. Bancos de oócitos doados podem ser criados da mesma forma que os bancos de espermatozóides para atender a população que continua crescendo de mulheres precisando de óvulos doados.
 

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